​Par Ons Dakhlaoui
Équipe Étude des Matériaux par Microscopie Avancée (LEMMA)

La polarisation dynamique nucléaire (DNP) est une technique d'hyperpolarisation qui améliore la sensibilité des expériences de résonance magnétique nucléaire (RMN) à l'état solide. Cependant, son utilisation pour les biomolécules est limitée par un élargissement des raies et une perte de résolution induits par le gel de la dynamique locale à la température cryogénique nécessaire pour la DNP, ce qui entraîne une hétérogénéité conformationnelle. Pour pallier à ce problème, notre groupe a introduit une méthodologie de DNP sélective (SelDNP), qui permet de récupérer des spectres hautement résolus, spécifiques aux sites de liaison des protéines. Elle repose sur la polarisation uniforme obtenue avec la DNP conventionnelle sur un premier échantillon et sur l'élargissement localisé de certaines raies produit par une étiquette paramagnétique introduite sur la protéine dans un deuxième échantillon. La différence entre les deux spectres permet d'obtenir des sous-spectres hautement résolus contenant uniquement les résonances proches du site ciblé par l'étiquette. Outre l'attribution des résonances de la région ciblée, les spectres SelDNP contiennent des informations sur la distance à l'étiquette au travers du facteur de sélectivité utilisé pour pondérer la spectroscopie de différence. La preuve de concept de SelDNP a été démontrée sur le site de liaison du β-D-galactose de LecA. La fonctionnalisation du ligand avec l'agent polarisant a permis d'obtenir simultanément des effets d'élargissement sélectif des raies proches du site de liaison et une polarisation uniforme du reste de la protéine par DNP. Bien que concluante, cette stratégie est limitée par la synthèse spécifique du ligand fonctionnalisé et l'incapacité d'optimiser indépendamment la sélectivité et la sensibilité.
Lors de ma thèse, nous avons abordé ces limitations en proposant des alternatives capables de cibler des régions diverses de la protéine en utilisant des étiquettes génériques. Ainsi, nous avons utilisé des étiquettes de type iodoacétamide pouvant réagir sur une cystéine particulière de la protéine dans une approche de marquage de spin dirigée, permettant l'étude de toute région exposée de la protéine. Nous avons testé une étiquette à base de l'agent polarisant bis-nitroxide AsymPol, qui offre à la fois la sélectivité et la sensibilité par DNP, ainsi qu’une étiquette TEMPO, qui ne produit qu'un élargissement ciblé des raies des sites avoisinants. Dans ce dernier cas, l'ajout de l'agent polarisant est optimisé indépendamment. Les deux étiquettes ont permis d'obtenir des spectres SelDNP hautement résolus ne contenant que les signaux de la région autour de la cystéine étiquetée.
En se basant sur le fait que l'hyperpolarisation et l'élargissement sélectif des raies peuvent être traités séparément, nous avons étendu la méthodologie SelDNP aux métalloprotéines. Dans ce cas, les ions diamagnétiques sont remplacés par des ions paramagnétiques équivalents pour produire l'élargissement spécifique des raies autour du site de liaison de l'ion. Comme pour l'approche précédente utilisant TEMPO, la DNP est obtenue grâce à l’agent polarisant ajouté de manière non-spécifique.
Finalement, nous avons cherché à exploiter SelDNP pour étudier l’interaction lectine-sucre compliquée de la lectine PilA. Outre sa relevance biologique, l'interaction de PilA avec les glycosphingolipides (GSL) n'a pas encore été décrite au niveau atomique par une technique conventionnelle de biologie structurale. Afin de résoudre ce problème par SelDNP, nous avons établi le protocole de production de la protéine marquée, puis tenté de prouver l'interaction avec les GSL par une technique contemporaine, avec pour but de fonctionnaliser le ligand GSL avec du TEMPO pour SelDNP. Nous avons réussi à obtenir une quantité suffisante de protéine pour tester l'interaction putative à l'aide d'un large éventail de techniques. Malheureusement, cette affinité n'a pas pu être démontrée, empêchant ainsi l’utilisation de SelDNP.